Carlos I con Margarita de Parma en la cuna y su madre.
Carlos mantuvo apasionadas relaciones con una joven, Juana Van der Gheynst, hija de un tapicero de Audenarde, villa en donde Carlos había reunido a la Orden del Toisón de Oro. Fruto de aquella relación fue Margarita de Parma, Gobernadora de los Países Bajos durante el reinado de Felipe II. La niña fue tutelada por Margarita de Saboya y a ese afecto y educación debió su posterior encumbramiento. No corrió igual suerte otra hija natural del emperador, Juana, nacida en 1522, por la relación amorosa con una joven del entorno del conde de Nassau. La niña murió a los dos años de edad en un convento de Madrigal de las Altas Torres, donde había sido alojada junto con la madre, bajo la tutela de la madre abadesa, doña María de Aragón, hija natural, a su vez, de Fernando el Católico. Una cuarta hija natural, Tadea, también nacida en 1522, hija de Ursolina della Pena, todavía vivía en Roma en 1562. Está claro que Carlos tuvo unos agradables y fogosos 21 añitos. Como es sabido Juan de Austria (1545-1578) nació vinticuatro años después, en 1545, fruto de la relación con Bárbara de Blomberg. En total los hijos naturales, conocidos, fueron cinco, ninguno de ellos nació durante su matrimonio con Isabel de Portugal, con la que tuvo otros cinco, de los que sobrevivieron: Felipe (n.1527), María (n.1528) y Juana (n.1535).
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